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腺病毒纯化应用案例-L

NanoGel Macro 50Q 是一种超大孔离子交换层析介质(树脂),适用于各种病毒类生物大分子纯化。NanoGel Macro 50Q 在纯化腺病毒上具有着较大优势,主要体现在以下几方面:放大更容易实现,载量更高,速度更快,生产效率可成倍增加。传统生物分子分离的层析介质孔径较小,通常小于500Å,所以腺病毒载量较低,另外有些填料疏水性过强也不适于腺病毒纯化。这里对从重组腺病毒样品进行试验,本次研究表明 NanoGel Macro 50Q 其超大孔结构使得更多病毒颗粒可以进入填料内孔进行交换结合具有更高载量 ;其高度亲水化设计,确保病毒较高回收率。
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应用描述
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  NanoGel Macro 50Q 是一种超大孔离子交换层析介质(树脂),适用于各种病毒类生物大分子纯化。NanoGel Macro 50Q 在纯化腺病毒上具有着较大优势,主要体现在以下几方面:放大更容易实现,载量更高,速度更快,生产效率可成倍增加。传统生物分子分离的层析介质孔径较小,通常小于500Å,所以腺病毒载量较低,另外有些填料疏水性过强也不适于腺病毒纯化。这里对从重组腺病毒样品进行试验,本次研究表明 NanoGel Macro 50Q 其超大孔结构使得更多病毒颗粒可以进入填料内孔进行交换结合具有更高载量 ;其高度亲水化设计,确保病毒较高回收率。

 

简介

 

  腺病毒商业化生产中主要采取悬浮培养的方式,其特点在于无血清培养,不含任何动物源成分,这样也非常有利于其分离纯化。目前灌注培养方式可以在高密度细胞培养条件下大量生产腺病毒。腺病毒上游生产能力提升给下游纯化带来一定压力。

 

 

图 1. 腺病毒纯化的工艺流程

 

  传统腺病毒纯化采用氯化铯密度梯度超速离心工艺。超速离心虽然具有操作工艺参数简单,回收率高等优势,但其无法线性放大也成为制约腺病毒等病毒类纯化的关键。凝胶过滤方法在常规病毒颗粒纯化中具有着一定的可行性,但其上样量小也限制了在病毒纯化上的大规模应用。
  NanoGel Macro 50Q 在纯化腺病毒上具有着较大优势,主要体现在以下几方面:放大更容易实现,载量更高,速度更快,生产效率可成倍增加。传统生物分子分离的层析介质孔径较小,通常小于500Å,所以腺病毒载量较低,另外有些填料疏水性过强也不适于腺病毒纯化。纳微公司针对腺病毒等病毒类分子,推出大孔系列填料 NanoGel 50Q 及超大孔系列 NanoGel Macro 50Q 。
  该系列填料具有单分散硬胶良好的机械强度和大孔结构,同时又具有高度亲水化的内孔表面修饰。对于很多病毒类分子具有更高的载量,更好的纯度及回收率。

 

 

图 2. NanoGel 50Q macro 化学结构(3500Å)

 

  由于 NanoGel Macro 50Q 采用的是单分散基质聚苯乙烯材质,因此具有非常优异的机械强度,同时又具有更高的柱效,图 3 是 300mm 直径层析柱装填效果。

 

图 3. NanoGel 50Q 柱效测定

 

材料与方法


纯化前纯度分析

  在纯化前,用 SEC 方法(G5000)和 SDSPAGE进行纯度分析。

 

 

图 4. 纯化前 SEC(G5000)纯度分析

 

 

图 5. 纯化前 SDSPAGE 纯度

 

NanoGel 50Q macro 纯化
  Nanogel Macro 50Q 装填在 7.7 × 25 mm(柱体积[CV],1ml)中,并上样了重组腺病毒溶液 40 BV(滴度2.2E+10IFU/ml,Cond:24ms/cm)通过对纯化后与纯化前纯度的比较和回收率的测定,评估NanoGel Macro 50Q 是否是腺病毒纯化层析较为理想的介质。

 

实验结果及分析


NanoGel Macro50Q 载量结果及分析

 

 

图 6. NanoGel Macro50Q 上 AdV 载量测试图谱

 

 

图 7. AdV 动态流穿载量拟合

 

  结合电泳及 HPLC 分析,采用滴度 2.2E+10IFU/ml的腺病毒样品进行吸附试验,10%流穿条件下,上样体积约 42 个柱体积。

 

NanoGel Macro50Q 洗脱优化结果及分析

 

图 8. NanoGel Macro50Q 优化梯度图谱

 

图 9. 步级纯化 SDSPAGE 分析

 

 

图 10. 步级纯化 HPLC-SEC 分析

 

 

表 1. 回收率统计表

 

  实验采用 Nanogel Macro 50Q 填料,pH7.0 条件下,上样量 40CVs(2.2E+10IFU/ml)实验结果显示:其纯化后纯度与提供的标准品一致,同时回收率达到 95%以上。

 

结果和讨论

 

  腺病毒纯化层析较为理想的介质需满足以下几方面要求:一,较大的孔径;二,较高的分辨率;三,高度亲水化衍生;四,较好的可放大性(包括较高机械强度,易于装填,较低反压,较快流速)。根据以上实验结果,NanoGel Macro 50Q 满足以上腺病毒纯化所需的所有属性要求。其超大孔结构使得更多病毒颗粒可以进入填料内孔进行交换结合,较传统小孔径填料具有更高载量 ;其高度亲水化设计,葡聚糖键合支链赋予其极高的亲水化表面,确保病毒较高回收率。
  综上所述,对于病毒类特别是重组腺病毒生产纯化,推荐采用对病毒具有更高载量的 NanoGel Macro50Q,可以确保生产效率更高,获得纯度更高的病毒颗粒以用于人体基因治疗或更安全的重组腺病毒疫苗。

 

参考文献:

 

  1. Gilbert PA, Garnier A, Jacob D, et al. On – line measurement of GFP fluorescence for the monitoring of recombinant adenovirus production. Biotechnol Lett, 2000.22:561- 567.
  2. Nadeau I, Jacob D, Perrier M , et al. 293SF metabolic flux analysis during cell growth and infection with anadenoviral vector. Biotechnol Prog, 2000. 16: 872- 884.
  3. Green AP , Huang JJ , Scott MO , et al . A new scalable method for the purification of recombinant adenovirus vectors. Hum Gene Ther , 2002. 13: 1921- 1934.
  4. Arcand N, Bernier A, Transfiguracion J, et al.Adenovirus type 5 ( Ad 5) chromatographic purification processat 20L scale. Bioprocess J, 2003. 2: 72-75.
  5. Fournier C. Langmuir 1995,11(7),p2344-2347)
  6. 美国专利 US5503933A
  7. 马羚,王弘扬,张霖等.5 型腺病毒一步层析纯化方案研究.病毒学报,2020.36(1).78-83.

 

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