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膜蛋白纯化应用案例

膜蛋白,又称跨膜蛋白( transmembrane protein) 或整合膜蛋白(integral membrane protein),嵌于细胞脂膜上,同细胞的许多生理过程相关,如通过载体系统和受体系统介导细胞质和细胞外环境间的物质交换和信息分子传递, 通过光合系统和呼吸链系统实现能量的产生和转换等。
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Recombinant proteins
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应用描述
Parameters

简介

 

  膜蛋白,又称跨膜蛋白( transmembrane protein) 或整合膜蛋白(integral membrane protein),嵌于细胞脂膜上,同细胞的许多生理过程相关,如通过载体系统和受体系统介导细胞质和细胞外环境间的物质交换和信息分子传递, 通过光合系统和呼吸链系统实现能量的产生和转换等。
  存在于细胞表面的膜蛋白,具有多种对细胞和生物组织至关重要的生物功能,因此,许多疾病均与膜蛋白功能异常有关。但针对膜蛋白的药物开发仍然面临巨大的挑战,这主要源于细胞膜的特殊结构和性质。此外,膜蛋白难以通过人工表达纯化的方式来研究,这是因为在离开细胞的环境后,膜蛋白会失去重要的生物特质,并可能会因此失去生物活性。实际上,在制药行业中,膜蛋白一直被认为是一种“不可成药”的药物靶标。


纯化路线


  通常情况下,多数膜蛋白的表达量极低 ,膜蛋白结构和功能研究的瓶颈在于缺少有效对膜蛋白的超量表达和纯化的技术, 以及进行结构研究的有效手段。目前常用的克服膜蛋白疏水性的方法是利用分子生物学技术构建含有融合亲和标签的重组膜蛋白,易于对目标蛋白进行修饰和操作。所以亲和层析是目前纯化整合膜蛋白最普遍的方法。

  由于本样品采用大肠杆菌表达的包涵体,生产出的膜蛋白通常具有细胞毒性,因此表达量也远低于常规重组蛋白。在整个纯化过程中都需要使用去垢剂Trtion 才能使膜蛋白本身保持空间构象和活性。由实验得出本样品需保存于不少于6M尿素中,故实验所用流动相均含6M尿素。纳微采用二步纯化,镍亲和捕获和NanoGel 50SP 精纯,纯化后由SDS-PAGE检测纯度达到 95%以上。

 

结果

 

  由上述实验结果可知使用 Ni FF 对包涵体进行纯化,包涵体可在尿素中保持其自身稳定性。在pH为8.0时,使用Triton作为淋洗液,使用一定梯度咪唑作为洗脱液时,纯度达到90% 以上。再使用离子填料进行纯化后,纯度可达到95% 以上。

 

注:获得完整版信息,请联系我们

 

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