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合成多肽的分离纯化应用案例

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应用描述
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简介

 

  肽(peptide)是氨基酸分子脱水缩合以肽键连接在一起而形成的化合物,根据组成氨基酸数量,肽有二肽、三肽、四肽、五肽等等。

 

 

图1 多肽结构示意图

 

  通常低于100个氨基酸组成的肽称为多肽,更大的多肽因空间结构对活性的决定性作用而称为蛋白质。

 

 

图2 多肽与蛋白质空间结构区别示意图

 

  多肽的最初来源为动植物组织提取或蛋白质水解(或酶切),随着技术和相关设备的进步,基因工程和固相合成成为多肽来源的主流,尤其是3-50个氨基酸组成的多肽,基本全部依赖固相合成获得。
  合成多肽主要应用于药物领域和化妆品领域等。常见的合成多肽原料药如胸腺五肽、谷胱甘肽、胸腺法新、奥曲肽、生长抑素和亮丙瑞林等。应用于化妆品添加的多肽如铜胜肽、乙酰四肽-5、乙酰基六肽-3、棕榈酰四肽-7和棕榈酰五肽-3等。


合成多肽纯化难点

 

  合成多肽的工艺路线主要包括有机合成、水解、色谱纯化、转盐,最后获得正确盐形式的高纯度产品。由于固相合成多肽涉及的底物(20种氨基酸的保护态)原料种类多,合成步骤(每延长一个氨基酸涉及两次反应)多,合成条件苛刻(如水解),因此最终拿到的粗品纯度很低(20%~40%不等),盐含量高,且关键杂质多(水解、脱氨杂质等)。

 

 

图3 多肽固相合成流程图

 

传统合成多肽纯化思路


  合成多肽,尤其是大于5肽的合成多肽的纯化,主要依赖制备液相色谱纯化。传统的多肽纯化选用以C18反相硅胶搭配三氟乙酸-乙腈的流动相的纯化体系,反复多步纯化以达到最终获得高纯度产品的目的,使多肽纯化的成本较高。


纳微科技合成多肽纯化新思路


  纳微科技利用产品种类多,应用实力强的优势,从100多种多肽纯化填料库中筛选了多种不同纯化模式中纯化效果较好的填料,组成多种综合纯化成本低的合成多肽色谱纯化工艺方案。
  由于多肽分子具有末端羧基、氨基和侧链可解离集团,分子会随环境pH变化呈现不同带电状态,因此多数合成肽可通过离子交换纯化;同时,由于多肽主体结构肽键和疏水侧链的疏水性差异,加之缓冲液离子对效应对净电荷的屏蔽,可以通过反相色谱纯化,包括聚合物反相色谱和C18硅胶反相色谱。


1.多肽的离子交换纯化(Uni-50XS+NanoQ-15L)


  传统工艺中,固相合成树脂水解下来的粗品先以大粒径反相硅胶(30-100μm)进行粗纯,但是由于粗品盐含量高,样品在反相硅胶的保留会大打折扣,导致制备上样量低,制备峰型变形,纯度提升效果差。
  纳微科技选用高分辨率的小粒径离子交换色谱填料捕获合成肽粗品,可以通过使用100%水相流动相稀释样品的形式大量上样而不流穿,且可以通过梯度洗脱达到较好的纯化效果。


  ● Uni-50XS


  UniQ-50XS是纳微科技推出的一款单分散聚甲基丙烯酸酯基架的强阴离子交换色谱填料。该款填料粒径50μm,具有极好的粒径分布和高分辨率,尤其适合合成多肽的捕获。该填料应用于胸腺法新的捕获,具有载量高、耐高盐、选择性好、纯度提升明显和收率高等特点。


  ● NanoQ-15L


  Nano系列色谱填料是纳微科技推出的单分散聚苯乙烯基架的精细离子交换色谱填料。其中30μm粒径可用于蛋白和多肽的中间纯化,10μm和15μm可用于精纯。其中NanoQ-15L在蓝铜胜肽的纯化中,可以直接满足高纯度产品的纯化需求。


2.多肽的聚合物反相纯化(UniPS 10-300)


  粗品经捕获步骤后,纯度提升的同时含有一定量的缓冲盐,经精细(10~40μm)聚合物反相色谱填料纯化后可得到纯度90%以上的产品。聚合物反相填料最大的特点是化学稳定性好,可通过各种强清洗手段(强酸,强碱和有机溶剂等)对多肽尤其是长链多肽带来的色谱柱筛板和填料微孔的污染和堵塞进行清洗,使用寿命可达数年。
  UniPS是以高交联度聚苯乙烯为基架的单分散聚合物反相色谱填料。可选粒径从3μm到50μm。制备型填料广泛应用于植提,多肽,造影剂,胰岛素等纯化领域。尤其在多肽纯化中具备类似C18硅胶的纯化性能,但耐酸碱等强再生条件,展现出超长的使用寿命。如UniPS 10-300在亮丙瑞林的纯化中,展现出类似C18硅胶的分纯化性能。


3.多肽的反相硅胶纯化(UniSil 10-120 C18)


  在离子交换或反相聚合物纯化的基础上,多肽纯度得到大幅提升且不能满足要求的情况下,C18反相硅胶可以作为最后精纯的选择。此时因产品纯度已经很高,无关杂质的污染少,且盐含量低,此时再选用反相硅胶纯化时,工艺载量高,满足纯化要求的同时填料寿命也有大幅提升。
  UniSil系列反相色谱是基于纳微科技独特的高纯度多孔硅胶基球生产的单分散色谱填料,具有多种键合相、粒径和孔径选择。在胰岛素、GLP-1、合成多肽和小分子纯化领域应用广泛,生产级别案例极多。如UniSil 10-120 C18在纯化特利加压素的应用上,展现出载量高、选择性好、纯度好、收率高等优点。


总结


  综合对比多肽纯化的几种潜在纯化方式,C18反相硅胶纯化因填料寿命低,使用高比例有机溶剂,使用昂贵高压设备而使得纯化成本最高;聚合物反相纯化有机溶剂消耗有所下降,填料寿命较长,成本占比很低,设备可采用高压或中压,成本居中;离子交换纯化基本不使用有机溶剂,流动相成本最低,填料寿命相较硅胶大幅提升,设备采用中低压,成本最低。因此对于合成多肽的纯化原则是优选离子交换,次选聚合物反相,再次选C18硅胶反相纯化;在单步不能满足要求时,尽量以离子交换和聚合物反相纯化替换C18硅胶反相纯化步骤,而C18硅胶反相纯化仅作为最后精纯把关。

 

注:获得完整版信息,请联系我们。


订货信息

 

 

 

*其他填料需求请与我们联系。

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